Cisneros es nombrado Arzobispo de Toledo en 1495. Anteriormente había sido el confesor de la Reina Isabel, sustituyendo al cardenal Mendoza al ser nombrado éste arzobispo de Toledo en 1492. Comienza con él uno de los momentos históricos más importantes de Alcalá. Cisneros acometió numerosas y grandes empresas y marcó de manera definitiva esta ciudad.

En 1497 se compromete en la construcción de "La Magistral". Para ello se decide la demolición de la vieja colegiata, que amenazaba ruina y por la que el arzobispo Alonso Carrillo nada había hecho. El proyecto, que se inspiró en la catedral primada de Toledo, fue terminado en el año 1514 y lo llevó a cabo don Pedro Gumiel.

El rango de "Magistral" lo adquirirá, a petición del propio Cisneros a la Santa Sede, en 1519, dos años después de producirse la muerte de éste. El nombramiento se produce el 1 de abril por bula otorgada por el Papa León X. Este privilegio sólo lo compartió con Lovaina y exigía que los canónigos tuvieran el grado de Doctor (Magíster) y catedráticos de la Universidad.

Cisneros es también el artífice y creador de la Universidad de Alcalá. Para ello solicitará al Papa autorización para crear unos "Estudios Generales" y la facultad para otorgar títulos. Con este fin, enviará a Roma en 1498 a Alfonso de Herrera, abad de San Justo, y el 13 de abril el Papa Alejandro VI otorgaba la bula por la que se confirmaban y ampliaban los privilegios dados en su momento a Sancho IV y también el de otorgar "grados" académicos y gozar de las competencias de las universidades de su tiempo.

El nombramiento provoca la construcción del Colegio Mayor de San Ildefonso, núcleo de la Universidad, y de su capilla anexa del mismo nombre, y que serían terminados en 1508. La construcción se hizo de manera rápida y se utilizaron el ladrillo, el yeso y la madera y la obra también fue realizada por Pedro Gumiel. Como el mismo Cisneros dijo; "otros harán en mármol y piedra lo que yo construyo en barro".

El 18 de octubre de ese año se comienzan a impartir las clases, siendo su primer rector don Pedro de Ocampo. En esta primera etapa, se crearon 46 cátedras de materias relacionadas con la Teología, las Artes Liberales, el Derecho Canónico y la Medicina. Para ello se contaba con siete colegiales de Salamanca y quinientos nuevos.

Además, en 1513 funda Cisneros siete colegios para estudiantes pobres; el de la Madre de Dios, para estudiantes de Teología y Medicina; el de San Pedro y San Pablo; el de Santa Catalina o de los físicos; el de Santa Balbina o de los lógicos; el de San Eugenio o San Ambrosio; el de San Isidoro o de los gramáticos y el Hospital de San Lucas.

Posteriormente, se fundaría el de San Jerónimo o Trilingüe y multitud de colegios mayores o menores por particulares y órdenes religiosas. Con esto quedará Alcalá convertida definitivamente en una ciudad universitaria a la que ingresarán muchos e ilustres alumnos como Tirso de Molina, Lope de Vega, Quevedo, Jovellanos etc.

Acometería también el Cardenal, con el apoyo del Papa y la reina Isabel, la reforma de los franciscanos. Fruto de esta reforma, se fundarán tres conventos de religiosas franciscanas o "clarisas"; el de San Juan de la Penitencia (1508), conocido como "las juanas"; el de las Clarisas de San Diego (1515),conocidas como las "almendreras"; y el de Santa Clara (1515), reedificado en el siglo XVIII por doña Beatriz de Silveira.

En el plano jurídico destaca la concesión por Cisneros, en 1509, del llamado Fuero Nuevo, compuesto por 142 leyes y que sustituiría al Fuero Viejo del arzobispo Raimundo y que regiría en otras localidades vecinas como Ajalvir, Daganzo, Los Santos o Santorcaz.

Otra de las realizaciones de Cisneros fue la introducción de la Imprenta. Ésta se inicia con la publicación de la "Vita Christi" de Landulfo de Sajonia, traducida del latín al castellano por Ambrosio Montesino (poeta de la corte de los Reyes Católicos). Pero la obra más importante será la Biblia Políglota Complutense, que exigió diez años de preparación y cinco para su impresión. Muchos fueron los problemas, tanto técnicos como de contenido, que se tuvieron que salvar. No existían caracteres hebreos, caldeos ni griegos, por lo que Cisneros decidió que viniera de Logroño el impresor alemán Arnao Guillé de Brocar, que labraría los primeros caracteres en estas lenguas de la historia. La Biblia consta de seis tomos; los cuatro primeros contienen el Antiguo Testamento; el quinto, el Nuevo Testamento; y el sexto es un apéndice. Aunque se terminó con anterioridad (en 1517), no se comenzará a vender hasta 1522 (cinco años después de la muerte de Cisneros).

Con la muerte de Cisneros en 1517 y la llegada a España de su nuevo rey, Carlos I de España, entra Alcalá en el Renacimiento. La primera decisión del rey fue la de apropiarse de los fondos legados por el Cardenal a la Universidad. Además nombraría a Guillermo de Croy, arzobispo de Cambray, para regir la sede primada. Éste ocupó dicho puesto de 1518 a 1521 y nunca fue bien visto por sus súbditos, que siempre fueron reticentes al nombramiento de un extranjero para tal dignidad. Ello hizo que en la Guerra de las Comunidades, Alcalá y su Universidad, tomasen partido por los Comuneros, más por razones de hostilidad al nuevo primado que por afinidad a la causa de éstos.

Tras el breve primado de Acuña, la sede va a permanecer vacante hasta 1524, año en el que se nombra arzobispo al cardenal Alonso de Fonseca. Éste ocupará la sede durante diez años. Al él se debe la construcción del ala occidental del Palacio Arzobispal que remataría, su sucesor, el cardenal Tavera en 1544. Bajo el mandato de éste último (1534-1545) se cumpliría la profecía de Cisneros y se iniciaría la construcción de la fachada renacentista de la Universidad que ha llegado a nuestros días. La obra se inicia en 1537 a cargo de Rodrigo Gil de Hontañón, arquitecto mayor de las catedrales de Salamanca y Segovia.

Durante esta época, el Palacio Arzobispal sería, de nuevo, residencia de los reyes españoles. Así, el 25 de diciembre de 1542, el Emperador Carlos I de España y V de Alemania, estando en dicho emplazamiento, anunció el casamiento concertado de su único hijo varón, el Príncipe de España, y la hija del rey de Portugal, y el del Príncipe de Portugal con doña Juana, su hija mayor.

A Tavera le seguirá don Juan Martínez de Siliceo (1546-57), bajo cuyo mandato se produjeron, entre otros, los desposorios de los príncipes de Éboli o el nacimiento de Miguel de Cervantes.

De 1558 a 1577 ocupará la plaza don Bartolomé de Carranza. En esta época visitará Alcalá el rey Felipe II, acompañado de su nueva esposa, la hermosa Isabel de Valois, que acababan de casarse en el Palacio del Infantado de Guadalajara. Tres años después, el monarca decretará la convalidación de los títulos académicos otorgados por las universidades de Alcalá, Salamanca y Valladolid.

Ya en 1568, con la intervención del propio rey, se consiguen recuperar los restos de los Santos Niños, que se encontraban en la iglesia de San Pedro el Viejo de Huesca.

Entre 1578 y 1594 regirá en la sede don Gaspar de Quiroga y Vela al que le tocó vivir la canonización de San Diego de Alcalá, cuyos restos descansan en La Magistral.

Posteriormente, le sucedería el cardenal-archiduque don Alberto, sobrino del rey. Éste, a los pocos meses de ocupar el puesto, renunciaría a él por la mano de su prima Isabel Clara Eugenia y el gobierno de los Países Bajos.

Finalizando el siglo, tomará posesión del puesto el obispo auxiliar, don García Loaysa y Girón, excolegial de la Complutense y fundador del Colegio Menor de San Clemente. Moriría éste en 1499, siendo enterrado en la cripta de los Santos Niños. Al excavar su tumba aparecieron unos restos que se atribuyeron a su antecesor Astúrico.