En 1492, al ser designado el cardenal Mendoza para ocupar la sede de Toledo y por consejo suyo, es llamado por Isabel la católica para ocupar el puesto de confesor de la reina. A partir de ese momento comienza una intensa vida pública y pasa a ser protagonista de muchos de los acontecimientos de la época.

En 1495, por designación de la reina, es nombrado arzobispo de Toledo. Será desde esta dignidad desde la que realizará sus mayores empresas. Llevará a cabo la reforma de la orden franciscana con el apoyo del papa Alejandro VI y de Isabel la Católica (1495-1500). Será el responsable de la creación de la Universidad de Alcalá (1498), de la Biblia Políglota Complutense (1514-1517) y la reconstrucción de la antigua colegiata (1497-1514) y de la obtención por parte de ésta del título de "magistral"(1519).

En 1499 dirige una campaña de evangelización de los moros granadinos, siguiendo las directrices de la corte, que provocó el levantamiento entre los moros de Granada y de las Alpujarras.

A partir de 1504, tras la muerte de la reina, Cisneros ocupa un lugar de primer orden dentro de la escena política.

En 1505, media entre Fernando el Católico y Felipe el Hermoso y logra que se llegue a la Concordia de Salamanca (septiembre de 1505), claramente favorable al primero. Desaparecido Felipe, preside la junta de la regencia y consigue el inmediato regreso de Fernando a Castilla, servició que éste premió con el capelo cardenalicio y confiándole la Inquisición. En 1507 inicia la conquista del norte de África que él mismo financia y que llegó a dirigir personalmente (conquista de Orán en 1509).

Por disposición testamentaria de Fernando es nombrado, por segunda vez, regente en enero de 1516, a pesar de la fuerte oposición del partido flamenco que apoyaba la candidatura de Adriano de Utrech. Tuvo que enfrentarse con grandes problemas de orden interno; brotes revolucionarios en Baeza, Úbeda, Cuenca y Burgos; pleitos nobiliarios entre Pedro Girón y Juan Alonso de Guzmán, entre el duque de Alba y la villa de Huéscar; ligas nobiliarias capitaneadas por el condestable de Castilla, el conde de Benavente y los duques de Medinacelli, Alburquerque e Infantado; y las insidias de la corte de Carlos V. Pero su energía y sagacidad hicieron que salvara todas estas controversias e imponer el orden, organizando la llamada "gente de ordenanza" (milicia ciudadana) a la que se oponían Valladolid, Burgos y León.
En política exterior su suerte fue varia. El intento navarrofrancés de restablecer en el trono a Juan de Albert fue evitado certeramente. No le fue posible, sin embargo, repeler los ataques de Barbaroja en el norte de África. A América envió a tres religiosos jerónimos con instrucciones muy estrictas que propiciaran la reorganización de las colonias.

Muere el 8 de noviembre de 1517 cuando se dirigía al encuentro de Carlos Quinto.