Realizada en la Universidad de Alcalá gracias al mecenazgo del cardenal Cisneros, sus trabajos se iniciaron en 1502 .

En ella participaron, entre otros, los conversos Alfonso de Alcalá, Pablo Coronel y Alfonso de Zamora, que se encargarían de la parte hebrea y aramea. La parte griega la trabajaron el cretense Demetrio Ducas y Hernán Núñez, el pinciano. Antonio de Nebrija intervino especialmente en la corrección de la Vulgata, texto latino de San Jerónimo.

Fue impresa por el impresor alemán Arnao Guillén de Brocar, que fue traído por el cardenal desde Logroño el año 1510. Como no existían por esa época caracteres griegos ni hebreos hubieron de ser éstos fundidos ex profeso y por primera vez.. Su imprenta se instaló en el Convento de las Clarisas. Éste, tras la muerte de Cisneros, abandonó la ciudad y nada se supo del material que utilizó para la impresión de la biblia.

Consta de seis tomos en folio.
Los tomos I al IV corresponden al Antiguo Testamento y comprenden: texto hebreo, el Tárgum de Onkelos en versión de los Setenta (ambos con traducción latina interlineal) y la Vulgata.
El tomo V contiene el Nuevo Testamento griego, en versión latina literal y la Vulgata. El tomo VI, es un apéndice con vocabulario hebreo y arameo y una gramática hebrea.

Destaca la distribución del primer tomo; las páginas en su tres cuartas partes superiores se divide en tres columnas que contienen; la izquierda el texto griego con la interpretación latina interlineal, la central la Vulgata, y la de la derecha la versión en hebreo. La parte inferior se divide en dos columnas; la izquierda para la traducción caldea y la derecha para la latina. Cada columna lleva sus epígrafes y, en el margen derecho, apostillas.

La impresión fue terminada en el año 1517, año de la muerte del cardenal, pero no vio la luz hasta el 1720, fecha en la que el breve León X autorizó su divulgación. La venta se retrasó por los litigios que hubo por la herencia de Cisneros y no se comenzó hasta el año 1722, cuando ya habían aparecido tres ediciones del Nuevo Testamento de Erasmo. Además muchos de los de los ejemplares impresos, que no fueron más de 600, se perdieron en un naufragio, por lo que la obra se convirtió en rara y difícil de encontrar.

La reedición no llegó hasta la época de Felipe II, impresa por Platino y dirigida por Arias Montano (Biblia de Amberes).

La Biblia Políglota Complutense es el primer esfuerzo consciente de la crítica europea del renacimiento aplicada a los textos bíblicos.